En periodo de pandemia de Covid_19, reconocemos la importancia de la realización de test que logren identificar los casos positivos para que el estado y en particular el Ministerio de Salud pueda implementar medidas acordes a la detección de casos positivos. En este contexto conversamos con la Académica Oriana Salazar, profesora Asociada del DIQBM quién en conjunto con un grupo de alumnos del Centro de Biotecnología y Bioingeniería, CeBiB quienes ayudaron a recopilar información referente a los distintos tipos de test que existen para entender por qué nuestro país optó por el RT-PCR.
“Disponer de un test rápido, sensible y específico es vital para el diagnóstico certero de Covid19, y proceder, por un lado, al tratamiento adecuado de los enfermos, y por otro, a su aislamiento que evite la propagación del virus”, indicó la Investigadora y profesora, Oriana Salazar.
Partamos por el más usado en nuestro país, RT-PCR (Reverse Transcriptional Polymerase chain reaction) a tiempo real, este procedimiento de detección tiene un tiempo de prueba de 3 a 4 horas y funciona a través de una toma de muestras de secreciones de las vías respiratorias, muestras que pasan por un proceso en el que se extrae el material genético para recuperar el ARN viral para luego ser convertido en ADN mediante la enzima Transcriptasa inversa. Continuando con el proceso se aplica un PCR (polymerase chain reaction) en el que otra enzima toma este ADN y replica un trozo en una reacción controlada por un computador mediante ciclos de temperatura. Esta enzima genera progresivamente un gran número de copias del ADN, y cada vez que genera una copia emite una pequeña fluorescencia que es detectada a tiempo real por el computador.
Finalmente, si hay presencia de los genes del virus, la muestra entregará cierto grado de fluorescencia que detecta la máquina lectora. Si el virus no está presente, entonces la máquina no detectará fluorescencia. Esta metodología tiene sobre un 90% de confiabilidad, y demora alrededor de 3-4 horas, aunque tiene la desventaja de requerir un laboratorio bien equipado y personal entrenado para su aplicación
El segundo que expondremos ahora es el llamado, LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) y tiene un tiempo de prueba entre 3 y 4 horas y es una técnica similar al RT-PCR, pero no usa cambios de temperatura. La muestra se convierte a DNA y luego es amplificada, en el proceso produce pirofosfato de magnesio que enturbia la solución. Por lo que los resultados pueden verse a simple vista.
La tercera prueba que puede realizar detección de Covid_19, se llama Lateral Flow y tiene un tiempo de prueba entre 15 y 20 minutos. Este procedimiento se realiza con una muestra de sangre de la persona se mide si hay presencia de Inmunoglobulina M (IgM) o Inmunoglubulina G (IgG) que son capturados por químicos en el test, de esta manera producen un cambio de coloración visible a simple vista.
Así también existe la prueba llamada ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Essay) y tiene un tiempo de prueba entre 1 a 3 horas, y se detecta realizando un proceso donde una superficie se adhieren proteínas del virus y luego se agrega una muestra de sangre de la persona. Si la persona ha desarrollado anticuerpos, estos deben adherirse a las proteínas del virus. Luego se elimina la sangre y se colocan anticuerpos que reconocen los anticuerpos de las personas, se elimina el exceso. Finalmente se agrega una solución que cambie de color si están presentes los últimos anticuerpos.
Otra de las metodologías validadas para la detección de Sars-Cov-2 es la Tomografía Computarizada y se realiza mediante la toma de tomografías de varias secciones del pecho, si el paciente está enfermo y con síntomas, algunas áreas se vuelven más opacas en las imágenes. La tomografía computarizada es más precisa que la radiografía, pero algunos equipos han propuesto analizar radiografías mediante inteligencia artificial para ayudar a distinguir mejor.
Por último, está el examen SHERLOCK y que realiza la detección a través del análisis del RNA viral que se transforma a ADN, luego es replicado y transcrito nuevamente a RNA. A continuación, el complejo Cas13 adherido a un RNA guía se une si el RNA es complementario produciendo fluorescencia.
Chile y el test RT-PCR
Inicialmente la detección del coronavirus en Chile se realizó mediante secuenciación que consistía en tomar muestras de secreción nasal, utilizado técnicas de NGS (next-generation sequencing), en la que se replican, simultáneamente, varias regiones del material genético del virus en una placa pequeña, que luego es analizada por un computador para descifrar esas secuencias genéticas replicadas. Esto permitiría tener una vista general del genoma patógeno sin necesidad de conocerlo previamente, sin embargo, Instituto de Salud Pública de Chile (ISP) demora entre 48 y 72 horas en dar el resultado.
La prueba RT-PCR es una técnica molecular y la más usada desde el inicio en el diagnóstico del Sars-Cov-2 en Chile. Al igual que la secuenciación, se basa en la replicación del material genético a partir de una muestra de secreción, pero en este caso se replica sólo una región específica del genoma. Ésta es una región que únicamente se encuentra en el Covid_19, por lo que es necesario contar con sondas específicamente diseñadas para detectar este virus, y sólo permite identificar al mismo, a diferencia de la secuenciación, que permitiría identificar otros patógenos. Sin embargo, el equipamiento para realizar el RT-PCR es más económico y está disponible en más laboratorios que los equipos para realizar secuenciación por NGS, y se demora menos tiempo, en este caso el ISP tarda solo 24 horas en tener el resultado. Es por esto por lo que nuestro país siguiendo las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS) decidió que el método oficial de detección de Covid_19 sería la prueba RT-PCR para diagnosticar la infección del virus.
Fuentes:
[1] What tests could potentially be used for the screening, diagnosis and monitoring of COVID-19 and what are their advantages and disadvantages?
https://www.cebm.net/covid-19/what-tests-could-potentially-be-used-for-the-screening-diagnosis-and-monitoring-of-covid-19-and-what-are-their-advantages-and-disadvantages/
[2] Udugama, B., Kadhiresan, P., Kozlowski, H. N., Malekjahani, A., Osborne, M., Li, V., Chen, H., Mubareka, S., Gubbay, J. B., & Chan, W. (2020). Diagnosing COVID-19: The Disease and Tools for Detection. ACS nano, 14(4), 3822–3835. https://doi.org/10.1021/acsnano.0c02624